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【重慶水處理設(shè)備網(wǎng)http://xqccscq.com/】水中的微生物水平（細(xì)菌、病毒、原蟲等）衡量水質(zhì)平安的重要指標(biāo)，水源性致病微生物通過飲水和直接接觸等途徑感染人體，存在傳達(dá)各類疾病的風(fēng)險(xiǎn)，關(guān)乎人群生命健康。由于致病微生物在環(huán)境水體中通常以較低濃度存在檢測(cè)過程中均需先對(duì)水樣進(jìn)行前處置將其濃縮成較小的體積。本文介紹了可用于水體中致病微生物富集濃縮的富集培養(yǎng)、離心、過濾和磁性分離等前處理方法的研究進(jìn)展，討論了不同前處理方法的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍，以實(shí)現(xiàn)水體中致病微生物的準(zhǔn)確檢測(cè)，真實(shí)反映致病微生物在水體中的賦存狀況，為水體中致病微生物分析檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)控制提供技術(shù)支撐。

研究背景

水是人類賴以生存的物質(zhì)，但水中存在各類污染源會(huì)損害人類和動(dòng)物的健康。水是污染病傳播流行的重要途徑之一。研究標(biāo)明，水中的微生物尤其是致病微生物是介水污染病傳播的重要因素，主要包括細(xì)菌(霍亂弧菌、大腸埃希氏菌、彎曲桿菌和沙門菌等)病毒(諾如病毒、腸道病毒、甲型肝炎病毒和輪狀病毒等)和原蟲(隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲、溶組織內(nèi)阿米巴蟲和圓孢子蟲等)根據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心疫情演講系統(tǒng)的數(shù)據(jù)，美國在1971至2020年期間因飲用水中致病微生物（包括14種細(xì)菌、3種病毒和5種原蟲）污染共引起675起疫情，累計(jì)造成497140人患病，276人死亡。歷史上霍亂弧菌曾引發(fā)多次世界范圍內(nèi)的霍亂大流行；由沙門菌、志賀菌、大腸埃希氏菌等引起的細(xì)菌性腹瀉在發(fā)展中國家也十分常見；此外，過去各國研究者對(duì)軍團(tuán)菌的研究都聚焦在噴泉水和空調(diào)冷卻水上，但近年來飲用水系統(tǒng)被軍團(tuán)菌污染的事件也多有發(fā)生，2020年美國疾病預(yù)防控制中心辦公樓因在供水系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)軍團(tuán)菌而被封閉。因此，通過水質(zhì)檢測(cè)對(duì)環(huán)境水體及飲用水中的致病微生物開展風(fēng)險(xiǎn)排查至關(guān)重要。

目前水中致病微生物的規(guī)范檢測(cè)方法基本都基于培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)，但是培養(yǎng)法因某些因素可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)不完全，如微生物受到非致命性的傷害、微生物不可培養(yǎng)、生長(zhǎng)溫度不適宜、生長(zhǎng)周期滿意足、超越非自養(yǎng)的存在時(shí)間等。近年來，國內(nèi)外基于不同的檢測(cè)原理研發(fā)了多種更加便利快速的檢測(cè)技術(shù)，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LA MP基于ATP生物熒光檢測(cè)、以及熒光定量PCR等。其中，分子生物學(xué)技術(shù)因具有高特異性和快速檢測(cè)的特點(diǎn)而逐漸得到廣泛應(yīng)用，這些方法可快速對(duì)多種致病微生物進(jìn)行高通量檢測(cè)，但在水體中的應(yīng)用主要受限于三個(gè)因素：1水體中致病微生物存在水平較低；2存在抑制分子生物技術(shù)（如PCR干擾物質(zhì)（如鹽度、腐殖酸）3游離核酸（死細(xì)胞釋放的核酸）耐久性，導(dǎo)致在隨后的分子檢測(cè)方法中呈現(xiàn)假陽性信號(hào)。因此，為了對(duì)水源性致病微生物進(jìn)行更為準(zhǔn)確靈敏的分析，采取適宜的前處理方法，對(duì)其進(jìn)行有效的富集和凈化是非常有必要的目前，國內(nèi)外僅對(duì)水體中腸道病毒的富集濃縮方法有相關(guān)報(bào)道，但對(duì)致病微生物富集濃縮方法相關(guān)研究進(jìn)展的總結(jié)分析較少，本文總結(jié)了水體致病微生物前處理方法的最新研究進(jìn)展，分析了不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用特點(diǎn)，以期為致病微生物高效便利的方法研究與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。 重慶實(shí)驗(yàn)室純水設(shè)備

1富集培養(yǎng)法

富集培養(yǎng)法是采用培養(yǎng)的方法對(duì)水樣中目標(biāo)微生物進(jìn)行增殖，以達(dá)到富集的目的根據(jù)微生物呼吸類型，富集培養(yǎng)法可分為好氧培養(yǎng)與厭氧培養(yǎng)。但是大多數(shù)微生物（大多數(shù)細(xì)菌，霉菌，放線菌等）需要有氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)的方法主要有：1固體培養(yǎng)法：培養(yǎng)基外表（如斜面與平板表面）完成微生物增殖培養(yǎng)；2液體培養(yǎng)法：把微生物接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。Wang等開發(fā)了經(jīng)過10~24h培養(yǎng)后用PCR檢測(cè)水中大腸埃希氏菌和腸球菌的方法，檢出限可達(dá)到0.2MPN/mLStrakova等通過一種基于離心、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)和選擇性培養(yǎng)條件的新型培養(yǎng)方法對(duì)廢水和地表水中的耐熱彎曲桿菌進(jìn)行分離，44%樣品中檢出彎曲桿菌陽性。從現(xiàn)有的研究來看，富集培養(yǎng)法在致病菌的富集濃縮中應(yīng)用較多，對(duì)病毒和原蟲的富集濃縮常采用的雞胚及雞胚器官培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)的體外培養(yǎng)模型，但這種方法目前主要應(yīng)用于藥物的開發(fā)，水體中的應(yīng)用較少。

鑒于細(xì)菌培養(yǎng)過程中大部分選擇性培養(yǎng)基只能培養(yǎng)特定的目標(biāo)菌株，無法滿足多種致病菌高通量檢測(cè)的需求，目前開發(fā)多重選擇性培養(yǎng)液以實(shí)現(xiàn)多種致病菌的同時(shí)培養(yǎng)成為了一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。Suo等開發(fā)了一種可以同時(shí)培養(yǎng)大腸埃希氏菌O157H7沙門菌屬和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌3種致病菌的SEL培養(yǎng)液，100~102CFU/mL接種濃度下，三種目標(biāo)菌株經(jīng)過1h非選擇性恢復(fù)期再37℃選擇性培養(yǎng)20h后均可富集到108~109CFU/mLQu等開發(fā)了一種可以同時(shí)培養(yǎng)沙門菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌 O157:H7和單核細(xì)胞增生李斯特菌的SSEL培養(yǎng)液，101~102CFU/mL接種濃度下四種目標(biāo)菌體37℃培養(yǎng)18h后均可富集到105CFU/mL

富集培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)是可以選擇性培養(yǎng)目標(biāo)菌株，同時(shí)可排除死菌和其他雜質(zhì)的干擾（如非目標(biāo)微生物、腐殖質(zhì)等）但該方法培養(yǎng)過程耗時(shí)且只適用于可培養(yǎng)的細(xì)菌或真菌的富集，限制了其在致病微生物檢測(cè)的前處置過程中的研究和應(yīng)用。

2離心法

基于離心的前處理方法是利用離心力使大小、形狀、密度和介質(zhì)粘度不同的顆粒從液體介質(zhì)中分離出來，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中最常用的技術(shù)之一，主要包括直接離心法和密度梯度離心法。 重慶純水設(shè)備

2.1直接離心法

直接離心法是直接對(duì)水中的微生物進(jìn)行離心，通過將大部分微生物沉降于管底來達(dá)到分離及富集濃縮的目的根據(jù)目標(biāo)微生物的大小不同可選擇不同的離心條件，原蟲體積較大，直徑＞3μm選用的離心力一般為（500~2000g細(xì)菌直徑一般為0.5~10μm常用的離心力范圍為（3000~12000rpm病毒直徑一般為0.01~0.1μm常用的離心力范圍為 90800~171000gBeheshtiMaal等以8000g離心10min后提取DNA 方法對(duì)伊朗伊斯法罕南部污水處置廠的進(jìn)水水樣進(jìn)行大腸埃希氏菌菌株的分離鑒定。生活飲用水規(guī)范檢驗(yàn)方法》GB/T5750-2023采用Filta-MaxXpress快速方法對(duì)飲用水中賈第鞭毛蟲/隱孢子蟲進(jìn)行測(cè)定時(shí)，采用的分離條件是2000g離心15minAhmed等對(duì)澳大利亞布里斯班某鄉(xiāng)村污水處置廠的進(jìn)水水樣進(jìn)行小鼠肝炎病毒測(cè)定時(shí)采用的分離條件是以100000g4℃下離心1h之后提取RNA 并結(jié)合RT-qPCR完成檢測(cè)，回收率為33.5± 12.1% 重慶純水設(shè)備

直接離心法的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

①方法本錢只涉及離心機(jī)的初始投資，使用中不需要化學(xué)試劑或其他高貴的消耗品；②速度快，可以在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)完成大體積水樣的處置；③方法操作簡(jiǎn)單，技術(shù)要求低，操作過程中不會(huì)引入其他物質(zhì)、試劑，對(duì)目標(biāo)微生物影響較小。

直接離心法也存在缺乏之處：①在富集目標(biāo)微生物的同時(shí)會(huì)對(duì)其他顆粒進(jìn)行富集，特別是對(duì)于高濁度的水樣，容易對(duì)后續(xù)操作（如核酸提取、PCR檢測(cè)等）造成影響；②離心后傾倒上清液時(shí)易造成目標(biāo)微生物損失。

2.2密度梯度離心法

密度梯度離心法是用一定的惰性介質(zhì)（蔗糖、甘油等）離心管內(nèi)形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，根據(jù)微生物在密度梯度液中的比重不同，通過離心力的作用使目標(biāo)微生物分離的一種技術(shù)。Garrison等在弗吉尼亞州諾?？说睦程睾雍秃沉魈实乃屑尤氪竽c埃希氏菌和鞭毛蟲后，采用蔗糖密度梯度離心法實(shí)現(xiàn)了對(duì)兩種微生物的富集。Chesnot等采用不同惰性介質(zhì)的密度梯度離心法實(shí)現(xiàn)了渾濁水樣中隱孢子蟲卵囊的富集，已發(fā)布的生活飲用水規(guī)范檢驗(yàn)方法》GB/T5750-2023中兩蟲檢測(cè)中也新增了密度梯度法。Hinzk等使用蔗糖密度梯度離心法根據(jù)微生物大小從海水中富集了細(xì)菌共生體。

密度梯度離心法的優(yōu)點(diǎn)：

①分離效果好，可一次獲得雜質(zhì)較少的目標(biāo)微生物；②適用范圍廣，既能分離沉降系數(shù)不同的顆粒，又能分離密度不同的顆粒；

該法存在局限性：

①成本昂貴；②需要制備惰性介質(zhì)溶液；③操作復(fù)雜，不易掌握。

3過濾法

過濾技術(shù)是以壓力作為推動(dòng)力的一種膜分離技術(shù)，膜孔徑范圍從小于2nm大于20μm不等。其分離機(jī)理主要有兩種：

1機(jī)械篩分，通過膜截留比膜孔徑大或與其孔徑相當(dāng)?shù)奈⑸镱w粒；

2吸附截留，當(dāng)微生物穿過膜外表進(jìn)入膜內(nèi)部時(shí)，利用膜自身的物理化學(xué)性質(zhì)和靜電引力使微生物堆積在膜孔側(cè)壁或膜內(nèi)部基質(zhì)上。根據(jù)膜孔徑大小，過濾技術(shù)可被分為微濾、超濾、納濾和反滲透，微生物前處置過程中主要采用微濾和超濾技術(shù)。

4磁性分離法

磁性分離是以磁性或可磁化的資料作為吸附劑的一種分離富集技術(shù)。大多數(shù)應(yīng)用于分離的磁性資料具有超順磁性，即在通常情況下沒有磁力，外加磁場(chǎng)下可表示出磁性。重慶純水設(shè)備沒有磁場(chǎng)的情況下可以充沛地分散在溶液中，與目標(biāo)物結(jié)合，之后在外加磁場(chǎng)下聚集于容器一側(cè)，通過棄去溶液和重復(fù)洗滌來最大限度地去除抑制物。磁性資料只是載體，只有對(duì)磁性納米資料（MagnetNanoparticlMNP進(jìn)行外表修飾，使其具有抗體、抗生素（萬古霉素、達(dá)托霉素等）和化合物等識(shí)別基團(tuán)才干捕捉目標(biāo)微生物。

4.1免疫磁分離法

免疫磁分離是指用抗體修飾MNP基于抗體-抗原相互作用從水體中選擇性捕捉目標(biāo)微生物。Guven等用IgE標(biāo)志的免疫磁珠分離水樣中的大腸埃希氏菌，結(jié)合免疫分析技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為8CFU/mLQuang等用蛋白A偶聯(lián)殼聚糖修飾的Fe3O4磁性顆粒結(jié)合IgG抗體從濃度低至10CFU/mL水樣中分離出了霍亂弧菌。國施行的生活飲用水規(guī)范檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》GB/T5750.122023規(guī)定采用免疫磁分離熒光抗體法測(cè)定生活飲用水及其水源水中的賈第鞭毛蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊。Villamizar-Gallardo等使用抗輪狀病毒單克隆抗體功能化氟磁性納米粒子實(shí)現(xiàn)了對(duì)水中輪狀病毒的富集。

4.2基于抗生素修飾的磁性分離法

一些抗菌物質(zhì)能夠抗菌是因?yàn)槟芘c致病菌外表的一些生物結(jié)構(gòu)相互結(jié)合，利用這一特點(diǎn)將其與磁性粒子結(jié)合可以起到捕捉細(xì)菌的作用。Meng等用萬古霉素修飾的MNP捕捉水、牛奶和果汁飲料中的金黃色葡萄球菌，結(jié)合流式細(xì)胞儀，檢出限為33CFU/mLDing等用抗菌肽功能化磁性納米顆粒在較低濃度下（0.1mg/mL實(shí)現(xiàn)了對(duì)致病性革蘭氏陰性桿菌的半選擇性捕捉，較高濃度下（0.5mg/mL實(shí)現(xiàn)了對(duì)自來水和休閑水中大腸埃希氏菌的高效捕捉，捕捉效率大于97%

4.3其他

除了基于抗體和抗生素修飾的分離磁珠之外，還有一些其他經(jīng)過化合物改性的磁珠被用于致病菌、病毒分離。Zhan等制備了一種新型的胺功能化磁性Fe3O4-SiO2-NH2納米粒子，可捕獲水中的病毒（脊髓灰質(zhì)炎病毒1和致病菌（金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157:H7銅綠假單胞菌、沙門菌和枯草桿菌）回收率為92%~96.3%Huang等報(bào)道了用胺基修飾的硅包Fe3O4磁性納米粒子分離水和飲料中的大腸埃希氏菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌等多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，平均回收率達(dá)到88.5%~99.1%Bohara等用功能化鐵酸鈷納米顆粒基于疏水作用捕捉水樣中的革蘭氏陰性菌（大腸埃希氏菌）和革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）平均回收率分別為65%和95%雖然這些化合物修飾的MNP無法特異性的區(qū)分某個(gè)特定的種屬或者菌株，但這種廣泛性是抗體和抗生素等識(shí)別片段無法比較的因此這類磁珠的研究與開發(fā)也會(huì)是未來的熱點(diǎn)方向之一。

以上各種磁性分離方法的優(yōu)缺點(diǎn)匯總見下表，總的來說，磁性分離在致病菌和病毒前處置方面具有很大優(yōu)勢(shì)，可以快速有效地去除干擾物的同時(shí)富集目標(biāo)微生物，無論是與分子檢測(cè)方法還是其他檢測(cè)方法結(jié)合都具有巨大的潛力，但局限在于其在水中原蟲的富集應(yīng)用較少，此外，影響其穩(wěn)定性因素多。

表 各種磁性分離方法的優(yōu)缺點(diǎn)匯總

水體致病微生物檢測(cè)中樣品前處理方法

研究結(jié)論

水體致病微生物污染可對(duì)人類和動(dòng)物造成危害，引發(fā)介水傳染病，而水體中致病微生物濃度低、基質(zhì)復(fù)雜，對(duì)水樣進(jìn)行充沛的前處置可以提高水體中致病微生物的檢測(cè)能力； 重慶純水設(shè)備

從現(xiàn)有研究來看，常用的前處置方法主要包括富集培養(yǎng)法、離心法、過濾法、磁性分離法等；

各種水樣前處置方法各有特點(diǎn)，應(yīng)用過程中可根據(jù)不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍針對(duì)性進(jìn)行選擇；

基于現(xiàn)有前處理方法的缺乏，未來研發(fā)的重點(diǎn)應(yīng)該是最大可能排除雜質(zhì)干擾的基礎(chǔ)上努力減少前處置過程中目標(biāo)微生物的損失，如開發(fā)水體雜質(zhì)去除方法、開展水體中致病微生物的二次富集等，為實(shí)現(xiàn)水源性致病微生物高效、快速的檢測(cè)及水源性疫情爆發(fā)早期預(yù)警提供基礎(chǔ)。

表 水體致病微生物前處理方法的優(yōu)缺點(diǎn)及其適用范圍

水體致病微生物檢測(cè)中樣品前處理方法

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